极化巨噬细胞通过外泌体调节纤维／脂肪生成祖细胞(FAP)脂肪生成

　　巨噬细胞极化在大肌腱撕裂后的肌肉损伤过程中被观察到，包括肩袖肌萎缩和脂肪浸润。在我们之前的研究中，我们发现肌肉驻地纤维/脂肪祖细胞(FAPs)的纤维形成和白色脂肪形成导致纤维化和脂肪浸润，FAPs的棕色/米色脂肪形成促进肩袖肌再生。然而，极化巨噬细胞及其外泌体如何调节FAP分化仍然未知。

　　我们用M0、M1和M2巨噬细胞或M0、M1和M2衍生的2 × 109外泌体培养FAPs，并添加或不添加GW4869(一种外泌体抑制剂)。在体内，将M0、M1、M2巨噬细胞移植或纯化后的巨噬细胞外泌体(M0、M1、M2)注射到小鼠大面积肌腱撕裂后的冈上肌(SS)中(n=6)。术后6周采集SS，评估肌肉萎缩和脂肪浸润程度。

　　我们的研究结果表明，M2而不是M0或M1巨噬细胞刺激FAPs的棕色/米色脂肪分化。然而，外泌体抑制剂GW4869的作用减弱了这种作用。M2外泌体也促进了FAP Beige的体外分化。M2巨噬细胞移植减少冈上肌萎缩和脂肪浸润。体内注射M2外泌体可显著减少冈上肌的肌肉萎缩和脂肪浸润。

　　我们的研究结果表明，极化巨噬细胞通过其外泌体直接调节FAP分化，M2巨噬细胞衍生的外泌体可能成为RC肌萎缩和脂肪浸润的一种新的治疗选择。

　　肩袖(RC)撕裂是最常见的上肢原因肌肉骨骼医生访问。在50岁以上的患者中，高达20%的患者有症状性肩袖撕裂的证据，而在70岁以上的患者中，49%的患者被发现有肩袖撕裂[1]。虽然小范围RC撕裂修复的患者术后肩关节功能通常有明显改善[2]，但大范围或大面积RC撕裂修复伴随着高再撕裂率和不理想的临床结果。大面积RC修复的失败至少部分与RC肌肉的退变有关，这一过程通过肌肉萎缩、脂肪浸润和纤维化介导[3,4,5]。临床研究表明，肌肉萎缩和脂肪浸润(FI)是导致手术修复后临床预后不佳的独立因素[6,7,8]。然而，由于我们对肌腱撕裂后肌肉病理生理的潜在机制了解有限，目前尚无有效的治疗RC肌萎缩和脂肪浸润的方法。

　　来自慢性肌肉病理的证据表明，炎症，特别是单核吞噬细胞(MP)浸润，有助于肌肉变性[9]。促炎细胞因子如TNFα和IL-6刺激肌细胞凋亡和分解代谢，从而导致肌肉萎缩，如癌症恶病质和自身免疫性疾病[9,10]。先前的动物研究表明，肌腱撕裂后巨噬细胞募集增加，肌肉萎缩和脂肪浸润[11,12]。最近的临床研究证实，在全层肌腱撕裂的RC肌中，巨噬细胞的浸润伴随着炎症细胞因子水平的升高[13,14]。此外，巨噬细胞通过极化过程对不同的环境信号作出反应，采取不同的功能程序。根据其极化状态，巨噬细胞的表型分为2组:M1(经典活化的巨噬细胞)和M2(交替活化的巨噬细胞)[15]。既往研究表明，杜氏肌营养不良患者的慢性肌肉变性部分是由经典的促炎M1巨噬细胞引起的[16]。最近对RC肌肉免疫细胞的定量分析显示，肌腱损伤后伴随肌肉萎缩和脂肪浸润的M1和M2巨噬细胞数量显著增加[17]。我们之前的研究表明，肌纤维/脂肪源性祖细胞(FAPs)是RC肌肉纤维化和脂肪浸润的细胞来源[18]。然而，巨噬细胞浸润与FAP纤维/脂肪形成之间的关系尚不清楚。

　　细胞外囊泡(EVs)细胞间信号特性的发现为研究细胞间通讯开辟了新的途径。外泌体是一种起源于多泡内体室(multivesicular endosomal compartments, MVB)的外泌体，其大小在30至100 nm之间[19]。外泌体由多种类型的细胞产生，包括适应性免疫细胞和巨噬细胞[20]。它们含有大量的载货分子，包括mRNA、微rna、长链非编码rna (lncRNAs)、蛋白质和脂质[21,22,23,24]。我们实验室最近的研究表明，巨噬细胞来源的外泌体调节动脉粥样硬化中的造血和炎症[25]。外泌体已被证明是调节间充质干细胞成脂分化的介质[26]。然而，巨噬细胞来源的外泌体在FAP成脂分化调控中的作用尚不清楚。本研究的目的是确定极化巨噬细胞(M1和M2)及其外泌体在小鼠模型中对FAP分化、RC肌萎缩和脂肪浸润的调节作用。我们假设M1巨噬细胞促进FAP脂肪形成、RC肌萎缩和脂肪浸润过程，而M2巨噬细胞抑制FAP脂肪形成、RC肌萎缩和脂肪浸润过程。我们进一步假设这种作用是通过不同形式的巨噬细胞产生的外泌体介导的。

　　从C57BL/6 J野生型小鼠3个月时的SS肌肉中分离FAPs (N=4)。为了评估FAP BAT分化，我们从健康UCP1报告小鼠(UCP1 -luc2- tdtomato)1Kajim/J (N=4)的SS肌肉中分离了额外的FAP。简而言之，在细胞培养罩中，用无菌剪刀将SS肌肉切成1mm的小块。与0.2%胶原酶II在37℃无菌水浴中孵育90 min。加入洗涤缓冲液(F/10, 10%马血清，1 × HEPES)，室温下1500rpm离心5min。然后将上清转移到新的50ml离心管中。残余用洗涤缓冲液冲洗，并以1500 rpm转速旋转5分钟。新收集的上清液与上一轮的上清液混合。加入D2溶液(0.06% Collagenase II, 0.15% disase with washing buffer)， 37℃孵育30 min。然后将溶液通过一个70 μm的细胞过滤器(VWR International)，然后通过一个40 μm的细胞过滤器(VWR International)。用40 mL FACS缓冲液(2.5%FBS, 20 mM EDTA in PBS)洗涤过滤后的细胞，以1500 rpm转速旋转5分钟。丢弃上清，用500μL的FACS缓冲液重悬细胞微球。细胞与anti-CD31-FITC (BD bioscience, Clone 390)、anti-CD45-FITIC (BD bioscience, Clone WM59)、anti-integrin α7-APC (R&D systems, Clone #334908)和PE-Cy7-Sca1 (BD bioscience, Clone)孵育。E13-161.7)和抗cd140a - bv421 (BD bioscience, Clone APA5)进行60分钟的筛选，然后使用FACSAria?II (BD bioscience)进行分类。FAPs作为CD31-/CD45-/ITGA7-/Sca1 + /CD140a +细胞群收集(附加文件1:图S1)[27]。

　　分选后，以每孔5000个细胞的密度将FAPs接种到1% Matrigel预涂覆的24孔板中(室温下1小时)。FAPs细胞用标准细胞培养基(SM) (Ham 's F-10, 10%胎牛血清，10 ng/ml bFGF和1%抗生素-抗真菌溶液，Thermo Fisher Scientific, MA USA)培养一周。一到三天后，FAPs附着在培养皿上。7天后，FAPs在24孔板内增殖至50-70%的融合度。在成脂分化培养基中，FAPs在14 d内分化为白色脂肪细胞(perilipin A阳性，UCP-1阴性)和棕色脂肪组织(perilipin A阳性，UCP-1阳性)。在成纤维分化培养基中，FAPs分化为成纤维细胞(Col1A和aSMA阳性，UCP-1阴性，perilipin A阴性)。成脂细胞用成脂分化培养基(100 μM IBMX, 2.5 μM DEX, 100 mM吲哚美辛，10 μg/ml胰岛素)培养2周。对于外泌体的处理，将巨噬细胞衍生的2 × 109个外泌体(M0, M1, M2)加入FAP细胞培养基。每隔一天添加新鲜外泌体，持续14天。

　　小鼠巨噬细胞(Raw 264.7, ATCC #TIB-71)用含有10%牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养(GIBCO, CA, USA)。为了使巨噬细胞极化为M1亚型，用100 ng/ml LPS加50 ng/ml IFNγ处理巨噬细胞7天;在DMEM/F-12中分别用10 ng/ml IL-4和IL-10处理巨噬细胞7天，使巨噬细胞极化为M2亚型。M1巨噬细胞用流式细胞术定量为cd11b + cd68 + cd11c + /cd206 -细胞，M2巨噬细胞用流式细胞术定量为cd11b + cd68 + cd11c - /cd206 +细胞。未极化巨噬细胞M0定义为cd11b + cd68 +细胞，如前所述[28]。

　　M0、M1和M2骨髓源性巨噬细胞分泌的外泌体使用最近描述的缓冲密度梯度超离心(C-DGUC)方法纯化[29]。骨髓源性巨噬细胞来源于C57BL/6 J (n=3)小鼠骨髓，经M-CSF诱导7 d。然后将巨噬细胞分化为M1和M2细胞，收集培养基，分离外泌体[25]。简单地说，从巨噬细胞中收集细胞培养上清，平均存活率为95%。为了避免外泌体被FBS污染，使用外泌体耗尽的FBS (Thermo Fisher, CA, USA)进行巨噬细胞培养。上清液在4℃下400 g离心10 min，使死细胞和碎片成球，然后在4℃下2000 g离心20 min，使碎片和大囊泡消失。然后用0.2 μm滤纸过滤上清，并在60%的碘醇缓冲垫(Sigma-Aldrich, MO, USA)上以100,000 g离心3 h (Type 45 Ti, Beckman Coulter, IN, USA)。采用OptiPrep密度梯度(5%，10%，20% w/v碘二醇)，在4°C (SW 40 Ti转子)下进一步纯化100,000 g外显体，纯化时间为18 h。之后，从试管顶部开始收集12个1ml的馏分。梯度的第七部分用Slide-A-Lyzer MINI透析装置(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)在PBS中透析，并用于后续的实验和分析。外泌体的大小和浓度采用NanoSight LM14 (Malvern Instruments, Westborough, MA, USA)测定，检测波长为488 nm。详细的特征描述在附加文件2中:图S2。所有外泌体在4℃保存，分离后1个月内使用。

　　将FAPs接种于24孔板中，每孔密度为10万个(每种巨噬细胞条件n=6)，并将25万个巨噬细胞接种于transwell培养插入物(cat# 3413, corning, IL, USA)。两种细胞与含有10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌药的相同的F-10培养基共培养14天。用PFA固定FAPs，用perilipin A和UCP1染色。然后用PFA固定巨噬细胞，并用cd11b和cd202染色。用流式细胞术定量极化效率。外泌体抑制实验采用1 μM GW4869 (cat # D1692, Sigma, CA, USA)， 0.1% DMSO作为对照组。

　　PDGFRα-GFP FAP报告小鼠(3个月大，N=24, Jackson laboratory Corp, Sacramento, CA, Stock # 007669)接受单侧肩袖撕裂手术，完成冈上肌和冈下肌肌腱横断和肩胛上去神经横断(TT + DN)。[30]假手术，其中肌腱和神经暴露，但不横断，在对侧进行。这种假手术已被证明不会引起肩袖肌萎缩或脂肪浸润[31]。分别于术后1、2、6周处死PDGFRα-GFP FAP小鼠，取RC撕裂侧和假侧冈上肌进行组织学检查(每组n=5)。假手术证实侧侧完整的肩袖肌腱和肩胛上神经。所有手术均在吸入性麻醉下进行。吸入麻醉时，先将小鼠置于含5%异氟醚的1L氧/分钟的腔室中，直至小鼠不活动且呼吸深缓。然后将小鼠从腔室中取出，戴上鼻罩放在工作台上，手术期间给予1L /分钟的氧气和2%异氟烷。

　　成年雌性野生型C57BL/ 6j小鼠(n=16, Jackson实验室公司，萨克拉门托，加利福尼亚州，股票号000664)和成年雌性PDGFRα-GFP报告小鼠(n=16, Jackson实验室公司，萨克拉门托，加利福尼亚州，股票号0007669)在3个月大时进行单侧肩套撕裂手术，完成冈上肌和冈下肌肌腱横断和肩胛上神经断断(TT + DN)。[30]将10μL磷酸缓冲液(PBS)极化后的M1、M2巨噬细胞和25万个未诱导的M0细胞与10μL Matrigel混合，于肩袖损伤当天移植至冈上肌。对照组手术时给予PBS 10μL加Matrigel 10μL。手术后6周处死小鼠，此时脂肪浸润明显，如既往研究所述[30]。每组采用C57BL/6 J小鼠(n=4)进行组织学分析，采用PDGFRα-GFP报告小鼠(n=4)进行免疫化学。我们在损伤后6周处死小鼠，因为我们之前的研究已经确定这是确定FAP分化的关键时间点[18]。SFVAMC机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了动物的所有程序和处理。实验设计的详细原理流程图见附加文件3:图S3。

　　成年雌性野生型C57BL/6 J小鼠(n=16, Jackson laboratory Corp, Sacramento, CA, Stock # 000664)在3个月大时接受了单侧大面积肩袖撕裂手术，并进行了完整的冈上肌和冈下肌肌腱横断和肩胛上神经断断(TT + DN)，如先前所述[31]。然后将小鼠随机分为四组(每组4只)。将溶解于PBS中的M0、M1和M2外泌体2 × 109注入冈上肌。对照组术中注射PBS 20μL。根据以往经验，术后6周脂肪浸润明显时处死小鼠[18]。S1。

　　取双侧冈上肌(SS)，处死小鼠后，在肌肉/肌腱连接处切除剩余肌腱和瘢痕组织。然后将肌肉在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻，并用低温恒温器以10 μm的厚度进行切片。油红o (Sigma-Aldrich, Burlington, MA)染色是为了评估肌肉切片的FI，如前所述[14]。三色染色评价纤维化指数。在4%多聚甲醛中固定，PBS中冲洗后，切片在阻断液(0.1% Triton X-100, 5%牛血清白蛋白在PBS中)中孵育1小时，然后与免疫染色的一抗(抗层粘胶蛋白，L9393, Sigma-Aldrich, 1:500稀释;anti-UCP1, sc-6529, Santa Cruz Biotechnology, 1:50稀释)，4°C过夜。PBS冲洗后，用二抗(1:50 000稀释)处理2小时。对于PDGFRα-GFP报告小鼠，使用Alexa Fluor 594偶联的抗兔IgG (ab150076)和Alexa Fluor 647偶联的抗山羊IgG (ab150131)的二抗。C57BL/6 J小鼠采用Alexa Fluor 488偶联抗兔IgG (ab150077)和Alexa Fluor 594偶联抗山羊IgG (ab150140)二抗。PBS冲洗后，载玻片用VectaShield加DAPI和盖片安装。用蔡司数码相机在Axio Imager 2型显微镜(蔡司)上拍摄组织学照片。通过将oil - red - o染色面积除以整个样本来评估脂肪面积分数[14]。通过将胶原染色面积除以整个样品来评估胶原面积分数[14]。

　　根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen, Inc.， Carlsbad, CA, USA)分离总细胞RNA。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Bioscience, Indianapolis, IN, USA)对每个样品使用1微克总RNA生成cDNA。Real-time qPCR用Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA)在Viia7 Real-time Detection System (Applied Biosystems, CA, USA)上运行。利用核糖体蛋白S26管家基因对感兴趣基因的表达水平进行归一化，并通过ΔΔCt方法对不同样本进行比较[32]。每组设6个生物重复。本实验使用的RNA量为1000 ng。本实验使用的引物序列列于附加文件4:Table S1。所有数据均以均数±标准差的形式表示。采用方差分析(ANOVA)进行统计学分析，p < 0.05为显著性[33]。本实验采用Tukey’s honest significant difference (HSD)事后检验。

　　图1

　　A-L TT + DN损伤后巨噬细胞增殖谱。免疫荧光染色显示，与假手术组比较，TT + DN组在损伤1周、2周、6周后巨噬细胞数量明显增加。M巨噬细胞百分比(cd68 +细胞数/总细胞数× 100%)在TT + DN后1周、2周和6周显著增加(与假手术相比^与假手术相比*与1周相比，#与2周相比，p < 0.05)。N M1的百分比用公式(cd86 + &cd68 +)/总cd68 + × 100%进行量化(*表示p < 0.05)。O) M2百分比采用公式(cd206 + &cd68 +)/总cd68 + × 100%(^与假手术侧比较*与1周比较，#与2周比较，p < 0.05)进行量化。

　　为了评估FAP的脂肪形成，在所有时间点使用山羊抗小鼠perilipin A (Cat#ab61682, 1:1000, Abcam, CA, USA)作为成熟脂肪细胞标记物，预结合小鼠抗小鼠αSMA-Cy3 (α平滑肌肌动蛋白Cy3，克隆1A4, 1:50 00, sigma-Aldrich, MO, USA)作为纤维化标记物和兔抗小鼠UCP1 (Cat#ab10983，棕色脂肪标记物，1:1000,Abcam, CA, USA)作为棕色脂肪组织标记物对FAP进行染色。然后用驴抗山羊FITC (Cat#ab150129, 1:2000, Abcam, CA, USA)、驴抗兔Cy5 (Cat#ab150075, 1:2000, Abcam, CA, USA)和DAPI (1:10 000, Sigma-Aldrich, MO, USA)染色。每个条件包括3个重复。通过将每张图像中表达periilipin的细胞数除以细胞核总数来确定脂肪生成指数。

　　为了测量TT + DN损伤后巨噬细胞的贡献，使用Axio Observer D1荧光显微镜在360 nm (DAPI)、480 nm (GFP)和570 nm(罗丹明)处捕获每块肌肉的全切片图像。利用图像分析软件，将颜色通道分为蓝色、绿色和红色。在每个肌肉样本中定量DAPI+、GFP+ (cd86-M1或cd206-M2)和罗丹明(cd68)+细胞。为了确定GFP/罗丹明双阳性细胞，每个样品中的绿色和红色通道图像重叠。GFP+ (cd86-M1或cd206-M2)、罗丹明+和GFP+/罗丹明+细胞在每个切片中由两名盲法审评员手工定量。计算每块肌肉中所有罗丹明+细胞中GFP和罗丹明双阳性细胞的百分比为GFP+ (cd86-M1或cd206-M2)和罗丹明(cd68)+细胞数/总罗丹明(cd68)+细胞数× 100%。对于其他染色，细胞的阳性百分比是指在染色和DAPI之间重叠的所有细胞核除以图像中DAPI阳性的总量。数据通过双向方差分析比较M1和M2巨噬细胞的百分比，并以平均值±标准差表示。

　　所需动物的数量是根据功率分析确定的，使用我们对真实效果的最佳近似，并使用假设α=0.05， ?=0.80， γ=0.8的预期样本可变性。通过这些计算，我们得出结论，每组最少需要4只动物。所有数据均以均数±标准差的形式表示。统计学分析采用方差分析(ANOVA)， p < 0.05为显著性[33]。本实验采用Tukey’s honest significant difference (HSD)事后检验。

　　摘要。

　　介绍

　　材料与方法

　　结果

　　讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　缩写

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

　　# # # # #

　　组织学分析显示，与假手术相比，肩袖手术TT + DN后1周、2周和6周的SS肌巨噬细胞百分比明显增加，M1在1周达到峰值，M2在2周达到峰值(图1)。M0的百分比在2周明显高于1周，但在6周时百分比没有明显下降。在肩袖损伤后M2的百分比中也观察到相同的趋势。M1的百分比在一周内显著增加;然而，与一周相比，两周和六周后的百分比明显下降。1周时M1与M2的比值为3.65±1.62,2周时为0.41±0.49,6周时为0.28±0.22(图1)。

　　FAPs与M0、M1和M2共培养14天后，与对照组相比，外周血A(+)脂肪细胞的百分比显著增加(图2A-H)。然而，M0、M1和M2组之间无显著差异。与M0、M1和对照组相比，M2组UCP1阳性棕色/米色脂肪(BAT) FAPs的百分比显著增加(图2K)。与STD组相比，与M1巨噬细胞共培养显著降低UCP1阳性BAT FAPs (p < 0.00001)。RT-PCR结果显示，与对照组相比，M0、M1、M2组脂肪生成标志物PPARγ-1和脂联素基因表达水平显著升高。米色脂肪生成标记面板，也称为UCP1, PRDM16和DIO2，在M0和M2共培养组中显著增加，但与对照组相比，M1组没有变化。这些数据表明，与M0、M1和对照组相比，M2巨噬细胞诱导FAP米色脂肪分化。

　　图2

　　与巨噬细胞(M0, M1和M2)共培养的FAPs (perilipin A- green， αSMA- red, DAPI-Blue)染色。E-H与巨噬细胞(M0、M1和M2)共培养的FAPs典型UCP1染色(UCP1- red, DAPI-Blue)。I总细胞中perilipin A阳性细胞的定量。J总细胞中αSMA阳性细胞的定量。K总细胞中UCP1阳性细胞的定量。L与对照组相比，各共培养组FAPs的成脂标记基因表达量(与PBS组相比*;#相对于M0;与M1相比，p < 0.05)

　　将GW4869添加到细胞培养基中，可以显著降低M2巨噬细胞诱导FAP脂肪形成的作用(图3A-H)。与共培养组相比，M0、M1、M2组脂肪细胞百分比与PBS组相比无明显变化。M0、M1和M2组间无显著差异(图3I)。外泌体抑制剂GW4869(图3E-H)也能减弱巨噬细胞对FAP BAT分化的影响。在M0、M1、M2组和对照组之间，UCP1阳性BAT-FAPs占FAPs总数的百分比没有差异(图3J)。外泌体的抑制消除了巨噬细胞调节FAP分化的作用。

　　图3

　　A- d与巨噬细胞共培养的FAPs典型的perilipin A和UCP1染色(UCP1-红色，perilipin A-绿色，dapi -蓝色)。E-H经GW4869(外泌体耗尽剂)处理的巨噬细胞共培养的FAPs的典型perilipin A和UCP1染色(UCP1-红色，perilipin A-绿色，dapi -蓝色)。1 .外周血蛋白A阳性细胞占细胞总数的定量。J与未共培养巨噬细胞的标准组比较，UCP-1阳性细胞占细胞总数(*)的定量;#相对于M0;&与M1相比;^与车辆组比较，p < 0.05)

　　FAPs用M0、M1和M2外泌体处理14天后，M0和M1组与PBS组相比，外周血蛋白A(+)脂肪细胞的百分比显著增加。然而，与PBS对照组相比，M2外泌体处理组没有发现差异(图4)。通过测量外周血蛋白A (+) FAPs的百分比，与M2外泌体相比，M1外泌体显著改善了FAP脂肪生成(p < 0.0001)。与M0、M1和PBS组相比，M2巨噬细胞外泌体显著增加了UCP1(+) BAT-FAPs。与对照组相比，M1巨噬细胞外泌体对诱导FAP BAT分化的UCP1表达无影响(p < 0.00001)。RT-PCR结果显示，与对照组相比，M0、M1和M2外泌体处理组ppar -1和脂联素基因表达水平显著升高。与PBS组相比，M2和M0外泌体组的BAT分化标记基因表达水平显著升高，但M1组(PRDM16除外)没有(图4)。M2巨噬细胞外泌体激活BAT基因表达，诱导FAP米色/棕色脂肪形成。

　　图4

　　A- d与巨噬细胞外泌体共培养的FAPs典型的perilipin A和UCP1染色(UCP1-红色，perilipin A-绿色，dapi -蓝色)。E .外周血蛋白A阳性细胞占细胞总数的定量。F各共培养组与对照组比较，各共培养组中UCP1阳性细胞占细胞总数G的脂肪形成标志物基因表达量(与PBS组比较*，与M0组比较#;与M1相比，p < 0.05)

　　组织学分析显示，与Matrigel相比，M2巨噬细胞移植在TT + DN损伤6周后，SS肌的肌肉重量减轻、脂肪浸润和纤维化明显减少(图5A-H)。此外，M2外泌体移植后SS的横截面积(CSA)显著改善(2002.2±63.9 (M2) vs 1418.7±62.3 (M1) vs 1678.7±45.0 (M0) vs 1607.5±71.8 (Matrigel)，图5L)。在M2巨噬细胞移植组中，UCP1的总表达量也显著增加(7.5±1.9 (M2) vs 1.5±0.7 (Matrigel)，图6G)。然而，M1移植组的UCP1表达降低(图5、6)。M2巨噬细胞移植减少了SS肌肉的脂肪浸润、纤维化和萎缩，并诱导了UCP1的表达。

　　图5

　　A-D巨噬细胞移植减少了肩袖损伤后6周的肌肉再生(TT + DN)。结果表明，M2可促进TT + DN术后肌肉再生。基质、M0、M1、M2移植中SS典型油红O染色图像(原放大倍数× 200)(脂滴红色)。E-H基质、M0、M1和M2移植中SS的典型三色染色图像(胶原蓝色，肌纤维红色，细胞核紫色)。I肩袖损伤后6周总肌重(TT + DN)与体重归一化。肌肉减重=([SS右SS左]/SS左)× 100%。脂肪浸润指数的量化以脂质面积占图像总面积的百分比来衡量。定量测量纤维化指数为胶原面积占图像总面积的百分比。L肌纤维横截面积定量，与PBS相比平均SD (*);#相对于M0;与M1相比，p < 0.05)

　　图6

　　M0和M1移植减少了肩袖损伤后6周的肌肉再生(TT + DN)。M2巨噬细胞移植可增强TT + DN损伤后FAP的增殖。A-D基质、M0、M1和M2移植(pdgfr α-绿色、ucp1 -红色、laminin -灰色、dapi -蓝色)中SS的典型免疫组化(原始放大倍数× 200)。E肌纤维大小百分比分布(csaum2)。F用pdgfr α-阳性细胞百分比除以细胞总数确定FAP增殖的定量。G用UCP1阳性细胞占总细胞的百分比定量UCP1表达(*与Matrigel组比较，#与M0组比较，当p < 0.05时与m1组比较)

　　组织学分析显示，与PBS相比，在损伤第6周注射M2巨噬细胞外泌体后，SS肌肉的体重减轻、脂肪浸润和纤维化明显减少(图7)。此外，M2外泌体治疗组与其他组相比，SS肌肉的横截面积显著改善(1794.6±147.2(M2) vs 1196.6±82.7(M1) vs 1418.7±62.3(M0)和1293.3±50.3 (PBS))。p=0.014图7)。与对照组(2.4±0.9,p=0.002)相比，M2巨噬细胞外泌体治疗组(13.7±2.2)的UCP1总表达显著升高(图7、8)。注射M2巨噬细胞外泌体可减少SS肌肉脂肪浸润、纤维化、萎缩，并诱导UCP1表达。

　　图7

　　M0外泌体注射减少了肩袖损伤后6周的肌肉再生(TT + DN)。M2外泌体注射增强TT + DN术后肌肉再生。A-D PBS、M0、M1、M2外泌体注射实验组SS典型油红O染色图像(原放大倍数× 200)(脂滴-红)。E-H PBS、M0、M1和M2外泌体注射实验组SS的典型三色染色图像(胶原-蓝色，肌纤维-红色)。I肩袖损伤后6周肌肉重量(TT + DN)与体重归一化。肌肉减重=([SS右SS左]/SS左)× 100%。J脂肪浸润指数的定量测量为脂质面积占图像总面积的百分比。定量测量纤维化指数为胶原面积占图像总面积的百分比。L肌纤维横截面积定量，平均SD(与PBS组比较*与M0组比较#与M1组比较，p < 0.05时)

　　图8

　　A-D PBS、M0、M1、M2外泌体注射组SS UCP1(原放大倍数× 200)的典型免疫荧光图像(UCP1 -红色、层粘胶蛋白绿色、dapi -蓝色)。E肌纤维大小百分比分布(csaum2)。F用UCP1阳性细胞占总细胞的百分比定量UCP1表达(与PBS组相比，* p < 0.05;与M0组相比;与M1组相比，p < 0.05)

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