氮饥饿条件下光吸收率对雨红球藻虾青素产量的影响

　　

　　

　　大量虾青素(a氮饥饿条件下产量约4% DW)Haematococcus pluvialis暴露于强光下的光生物反应器(PBRs)引起轻应力的条件。然而，在PBR中，大生物量co通常达到的浓度会导致强烈的光衰减条件，这使得分析这种“光应力”变得复杂。本研究旨在阐明光传递在虾青素细胞凋亡中的作用微藻的内涵和生产力Haematococcus pluvialis在氮饥饿期间。Haematococcus pluvialis在平板PBR中间歇式培养，突然氮饥饿co入射光子通量密度(PFD)为250μmolhν m?2 s?1。不同初始生物量concentrations (图形抽象

　　虾青素(3,3′-二羟基-β，β-1-胡萝卜素-4,4′-二酮)是一种天然存在的叶黄素，它与胡萝卜素一起构成了600多个类胡萝卜素分子。它是一种生物活性材料，在许多应用中都很有用，包括营养补充剂，药品，动物饲料和化妆品。它还表现出比其他类胡萝卜素如β-胡萝卜素和维生素E更高的抗氧化活性(Guerin et al. 2003)。

　　淡水单细胞微藻雨红球菌(Haematococcus pluvialis)已被认为是天然虾青素的最佳来源，因为它具有积累大量虾青素的潜力(Lorenz and Cysewski 2000;Ranjbar et al. 2008)。大多数公司采用两步法培养雨芽虾以生产虾青素(Harker et al. 1996;Olaizola 2000;Fábregas等人，2001;Han et al. 2013;Liu et al. 2020)。这一过程是根据雨水蛭的生命周期和细胞生物学发展起来的，主要包括至少两个阶段，绿色阶段是在有利的生长条件下提供充满营养的培养基，红色阶段是在逆境条件下营养物质(通常是氮)耗尽的阶段。在绿色阶段，细胞可以繁殖和积累生物量，但不能积累虾青素，而在红色阶段，细胞失去分裂和移动能力，但能够积累高达干生物量重量5%的虾青素(Kobayashi et al. 1997;Fábregas等，2001,2003;Kang et al. 2005)。

　　光和氮是影响雨水杨生长和虾青素合成最有效的两个因子。氮饥饿与强光相结合被认为是触发雨水杨虾青素积累的最佳途径(Boussiba 2000;sciilia et al. 2015;Zhang et al. 2018;Rizzo et al. 2022)。多年来，人们对其进行了广泛的研究，特别是对提高富含虾青素的雨水蛭生物量的研究。氮饥饿的后果之一是细胞中叶绿素浓度的降低，这极大地改变了微生物的光吸收，从而影响了它们积累虾青素的能力(Solovchenko et al. 2011)。

　　除了氮饥饿外，文献中还经常使用光胁迫这一术语作为虾青素高产的必要条件(Hu et al. 2008)。然而，光胁迫的概念仍然是定性的，特别是考虑到其在藻类培养系统中的定义的复杂性。实际上，光在培养体积中的穿透取决于雨芽孢菌悬浮液的浓度以及色素含量(即细胞的辐射特性)(Lee et al. 1987)。因此，优化光胁迫以优化虾青素的生产需要将所有这些影响联系起来，以准确地量化光胁迫。例如，适当的光胁迫会导致虾青素过度积累，这反过来会改变培养体积中的光穿透，然后光胁迫作用于细胞。

　　本研究的目的是探索利用一个物理参数的潜力，即平均光子吸收率(MRPA)，它提供了光合生物吸收光能的速率的信息。本研究旨在帮助了解光能的相关过程及其对虾青素生产的影响。在平板PBR中，研究了氮饥饿条件下雨芽微藻产虾青素速率与光吸收率的关系。为此，在250μmolhν?2 s?1的连续光强下进行了四次生物量培养。初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3，导致不同的光衰减条件。然后分析了生长动力学和虾青素积累的结果，以及由平均光子吸收速率MRPA表示的光传递条件。正如Kandilian et al.(2014)表明MRPA控制了大量微藻在细胞内以三酰基甘油的形式积累一样，本研究预计在雨芽虾青素积累方面也会有类似的结果。结果将有助于优化和确定pbr中虾青素的生产方案。

　　由于在培养皿中发生光衰减，已经开发了许多动力学模型，将微藻生物量和/或代谢物生产力与培养皿中的光传递耦合起来(Cornet等人，1992;Grima et al. 1994;Takache et al. 2009, 2012;Cornet and Dussap 2009;bacheet al. 2013)。注意到(Cassano et al. 1995)，光子吸收的特定局部速率(LRPA)在将光相关动力学(即光合作用)和光转移条件耦合时显示出了兴趣。表示单位生物量和单位时间单位重量光合有效辐射(PAR, 400 ~ 700 nm)光谱范围内吸收的光子量，单位为μmolhν kgx?1 s?1。取决于微藻的吸收截面(然后是细胞色素沉着)和在给定培养深度下获得的光谱影响率。因此，是一个局部值，必须在PAR区域和总培养体积上取平均值，才能获得平均光子吸收率(MRPA或< >)。

　　对于本研究中使用的平板PBR，只需将培养深度z上的局部值平均即可获得(Pruvost and Cornet 2012):

　　（1）

　　式中为微藻的光谱质量吸收截面(单位:m2 kg?1)，为深度z处的局部通量(单位:μmolhν m?2 s?1)，L为PBR的厚度(单位:m)， λ为光波长(单位:nm)。

　　在微藻培养的情况下，可以通过求解辐射传递方程(Jonasz and Fournier 2007)获得局部光谱影响率。对于响应一维假设的几何形状，如平板PBR的情况，双通量模型被证明也有效地描述了藻类悬浮液中的光扩散和吸收现象(Pottier et al. 2005)。然而，这要求确定后向散射比，即从悬架的散射相函数估计的向后散射辐射的比例。对不同种类的微藻进行了测量(Kandilian et al. 2014, 2019)，但对H. pluvialis尚未测量该值。但由于微藻细胞的后向散射比非常低，Lee et al.(2014)和Kandilian et al.(2016)证明，仅根据吸收特性的简化方法可以确定通量率场，然后确定MRPA，误差可以忽略不计，导致:

　　（2）

　　式中，qλ，0为入射PFD(μmolhν m?2 s?1)，ρλ为PBR后壁漫反射反射率(透明后壁ρλ=0)。

　　根据式2，通量率的简化表达式仅取决于微藻悬浮液的光谱质量吸收截面，必须使用带有积分球的分光光度计精确确定，以考虑微藻细胞的光散射(Kandilian et al. 2016)。Ferrel Ballestas等人(2023)最近将该方法用于在pbr中培养渐进氮饥饿条件下的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的培养并验证了该方法。

　　然后，通过对PAR区域上的局部值进行积分，可以得到PAR平均影响率:

　　（3）

　　雨生红球藻SAG 34-7菌株来自德国G?ttingen大学的藻类培养收藏。在改良的Bold’s Basal Medium (BBM;(Nichols and Bold 1965))，其组成为:NaNO3 8.824、MgSO4?7H2O 0.913、CaCl2?2H2O 0.17、Na2EDTA?2H2O 0.134、FeSO4?7H2O 0.05、K2HPO4 0.861、KH2PO4 0.9、ZnSO4?7H2O 7.72 × 10?4、Co(NO3)2?6H2O 1.51 × 10?4、CuSO4 6.25 × 10?7、H3BO3 4.6 × 10?5、MnCl2?4H2O 9.15 × 10?6、Na2MoO4 1.063 × 10?3和NaHCO3 15。

　　在氮饥饿实验中，培养基中不含硝酸盐(NaNO3)，其余组分保持不变。

　　所有实验均在1-L气升式平板PBR(厚度L=3 cm)中进行。Pruvost et al.(2009)对PBR进行了更详细的描述。

　　PBR的一侧由可调节PFD的白色LED灯面板连续照明。PBR设置了一个完整的通用传感器回路和微藻培养自动化，即pH，温度和气体注入(CO2和空气)。使用pH传感器(InPro48XX, Mettler-Toledo AG, Greifensee, Switzerland)测量pH值，当测量的pH值超过设定值时，在PBR内注入CO2将pH值设置为7.5±0.5，并在温度控制设置为21±1°C的室温下保持温度稳定。使用量子光传感器(Li-250A, Li-COR, Lincoln, NE)在PBR内表面的九个不同位置的PAR区域测量入射PFD。实验开始前，PBR用5 mM过氧乙酸溶液消毒30 min，用无菌去离子水冲洗2次。

　　最初，在最佳生长条件下(即低PFD为75μmolhν m?2 s?1)批量培养绿色雨水蛭细胞接种PBR。然后收集培养物接种氮饥饿实验，从而引发类胡萝卜素的积累。

　　收集特定体积的绿色雨淋菌培养物，在10000 g (ThermoScientific Sorvall RC 6 Plus，马萨诸塞州，美国)下在4°C下离心10分钟，用无氮BBM培养基洗涤两次，注入充满无氮培养基的新airlift-PBR中，并暴露于250μmolhν m?2 s?1的连续事件PFD中。根据每次突然氮饥饿实验所需的初始生物量浓度选择培养体积，遵循Van Vooren et al.(2012)设定的脂质积累方案。在pbr中分批培养10 d，研究了氮饥饿条件下各培养物的生长动力学和虾青素的产量。

　　干重生物量浓度

　　微藻干重浓度Cx通过预干燥和预称重的玻璃纤维过滤器(Whatman GF/F, 0.47 μm孔径，VWR，法国)过滤给定的培养体积，以重量法测量。过滤器在105°C下干燥至少24小时，然后在干燥器中冷却10-15分钟后重新称重。样品分三份分析，报告的生物量浓度与平均值相对应。

　　形态学观察

　　采用蔡司、Axio、Imager光学显微镜观察细胞形态变化。M2m，耶拿，德国)连接CCD相机(蔡司，AxioCam MRc，耶拿，德国)。

　　色素浓度

　　提取色素，分光光度法定量。Qiu等人(2018)首先将体积为V1 (mL)的雨芽草培养液在13400 rpm下离心15分钟。丢弃培养基，将细胞重悬于体积为V (mL)的二甲基亚砜(DMSO)中，然后在50°C下黑暗孵育1-2小时，直到样品变白。冷却后，用体积为V2 (mL)的90%丙酮(DMSO:90%丙酮的比例应等于1:4)稀释色素提取物，然后在13400 rpm下离心15 min。用紫外可见分光光度计(JASCO V-630，法国)在630、645、665和750 nm处测定上清液的光密度ODλ。所有提取分三次进行。叶绿素a (chl-a)和b (chl-b)浓度(单位为g m?3)计算如下(Strickland et al. 1968):

　　（4）

　　式中V1为培养样体积(mL)， V2为添加丙酮体积(mL)， l为比色皿路径长度(1cm)。

　　每干重生物量Wi对应的色素i质量分数(单位:DW %)可估计为:

　　（5）

　　式中Ci为色素浓度，单位为gm?3。

　　虾青素含量

　　采用DMSO提取虾青素，分光光度法定量，方法参照Boussiba et al.(1992)。收集藻类细胞V1, 11000 rpm离心10分钟，首先用5% (w/v) KOH和30% (w/w)甲醇溶液在70℃下处理10分钟，破坏叶绿素。加入100μL醋酸，涡流匀浆回收虾青素，用体积为V2的DMSO提取剩余球团(加入DMSO前需先加入乙酸，否则球团会结块，难以提取)。提取液在70℃下加热30分钟。收集红色上清液(11000 rpm离心10 min后)，测量490 nm光密度，并根据下式计算虾青素浓度Casta(单位:g m?3)(Zhang et al. 2018):

　　（6）

　　式中V1为培养样体积(mL)， V2为加入DMSO体积(mL)， OD490为490 nm处提取液光密度。

　　然后计算虾青素含量Wasta(单位:DW %):

　　（7）

　　辐射特性的实验测量

　　使用Kandilian et al.(2016)描述的方法测量微生物的辐射特性(即质量吸收截面)。利用UV-Vis-NIR分光光度计(Agilent Cary 5000, Santa Clara, CA)的内部积分球附件(Agilent Cary DRA-2500, CA)测量了生物量浓度在0.1 ~ 10 kg m?3之间的雨水仙悬浮液的法向半球透射率和反射率。

　　微藻样品在15°C下11000 rpm离心15 min，测量前用磷酸缓冲盐水(PBS)溶液洗涤2次，以免被生长介质吸收和散射，然后悬浮在PBS中。根据光学测量所需的生物量浓度(0.1-10 kg m - 3)选择取样的培养物体积和使用的PBS。使用1 cm深度的石英比色皿(11010-10 -40 Hellma Analytics, m

　　llheim, Germany)。在350 ~ 750 nm波长范围内(光谱分辨率为1 nm)，以实验测得的和为输入参数，反演了雨雨草的光谱质量吸收截面。然后用它们计算局部通量率和MRPA < >。

　　注意，在批量培养中，微藻的质量吸收截面以及生物量浓度Cx都是随时间变化的。在实践中，通过每天取样，分批培养的每日平均面积虾青素产量和每日平均光子吸收率< >计算为:

　　(8) (9)

　　其中ti和ti-1对应于间隔1天的连续两次采样时间。

　　摘要。

　　介绍

　　理论的考虑

　　材料与方法

　　结果与讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　缩写

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　在初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的条件下进行了4次突然饥饿试验。在所有情况下，PBR的正面暴露在250μmolhν m?2 s?1的入射PFD中。

　　突变氮饥饿条件下雨水杨的生长表现为生物量浓度Cx和叶绿素a、b含量Wchl的时间演化特征。结果如图1所示。

　　图1

　　

　　在PFD为250μmolhν m?2 s?1，初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的间歇培养条件下，突然氮饥饿时雨芽草叶绿素含量Wchl (a)和生物量浓度Cx (b)随培养时间t的变化。数据以mean±SD表示，n=3

　　在所有氮饥饿实验中，图1a清楚地显示了叶绿素含量Wchl随饥饿而下降。微藻悬浮在无氮培养基中后，立即观察到这种急剧下降。值得注意的是，在所有情况下(0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3)，在饥饿的前4天，叶绿素含量Wchl的下降幅度更大。叶绿素含量Wchl继续下降，但下降速度较慢。这个众所周知的结果可以用叶绿素在氮的内部储存中的作用来解释。细胞降解其叶绿素以支持细胞分裂，从而在缺氮条件下维持生长(Li et al. 2010;Van Vooren et al. 2012;Kandilian et al. 2014;Taleb et al. 2015, 2016;sciilia et al. 2015)。

　　图1b显示了在初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的条件下，分批培养的雨水浒生物量浓度Cx的时间演化。培养10 d后，4批生物量分别达到0.34、1.59、2.39和2.76 kg m?3。这一观察结果突出表明，当在缺氮培养基中培养时，随着时间的推移，Cx逐渐增加。Flynn et al.(1993)和Fan et al.(1998)先前对这种行为进行了记录和讨论。的确，在缺氮条件下，细胞在氮胁迫开始时开始分裂，但随着压力变得更加明显，细胞最终面临死亡。因此，它取决于细胞在没有氮的情况下继续分裂的能力。

　　虽然已经观察到高光强可以刺激虾青素的积累，但我们的研究结果揭示了一个值得注意的现象，即在非常低的初始生物量浓度下，特别是0.21 kg m - 3。在这些条件下，生长速度大大降低，导致生物量浓度和生产力降低。培养10天后，Cx、Px和Sx分别为0.34 kg m?3、14.5 g m?3 d?1和0.43 g m?2 d?1。

　　此外，我们观察到细胞漂白和死亡(如图2所示)。Wang等人(2013a, b)在极低初始生物量浓度(=0.1 kg m - 3)的氮饥饿条件下培养雨芽孢杆菌时，也发现了类似的现象。

　　图2

　　

　　培养第1天(b)和第10天(c)，在初始生物量浓度为0.21 kg m?3、PFD为250μmolhν m?2 s?1的条件下，1- l气升PBR (a)和雨浒苔细胞形态学变化(b和c)。受损或漂白的细胞用箭头表示。比例尺:200μm

　　然而，当PBR接种较高的生物量浓度(1.39和2.21 kg m?3)时，培养结束时的最终生物量浓度分别达到2.39和2.76 kg m?3。这对应于体积生物量生产力Px分别为99.66和55.33 g m?3 d?1。这一观察结果与Van Vooren等人(2012)、Wang等人(2013a, b)、Kandilian等人(2014)和Taleb等人(2015)先前的研究结果一致，强调了初始生物量浓度对最终生长的显著影响。值得注意的是，当初始生物量浓度为0.52 kg m?3时，最大体积生物量生产力Px为109 g m?3 d?1(对应于面积生物量生产力Sx为3.27 g m?2 d?1)。虽然较高的接种浓度导致较高的最终生物量浓度，但较低的接种浓度有利于较高的生长速率。因此，在初始生物量浓度为0.52 kg m?3的条件下，生长速度最有利。

　　随着时间的推移，这些不同的生长模式和色素的进化可以通过考虑光吸收在培养中的作用来阐明。Van Vooren et al.(2012)和Kandilian et al.(2014)的研究表明，氮饥饿条件下生长在pbr中的微藻培养物的光传递对细胞生长和代谢都有深远的影响。对于初始生物量浓度较低的培养物，较低的细胞密度确保细胞对培养物内可用光的可及性增强，从而导致代谢活性增强。对这些结果的更全面的分析将通过检查光子吸收的平均速率来提供，在随后的章节中由MRPA表示。

　　图3显示了在初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的条件下，分批培养的雨水浒虾青素浓度Casta和含量Wasta的时间演变。这表明细胞悬浮在无氮培养基中后，虾青素浓度立即增加。事实上，在初始浓度为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的实验中，细胞在4天后虾青素浓度分别达到1.46、2.66、1.48和1.21% DW。初始生物量为0.52 kg m?3的培养，培养10天后虾青素最终浓度最大值Casta为50 g m?3，最终虾青素含量最大值Wasta为3.21% DW。这与Wang等人(2013a, b)报道的在无氮条件下初始生物量浓度为0.8 kg m - 3时虾青素含量为2.7和3.8% DW的情况形成了良好的对比。

　　图3

　　

　　在PFD为250μmolhν m?2 s?1，初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3的条件下，突然氮饥饿间歇培养过程中雨芽水蛭虾青素浓度Casta (a)和含量Wasta (b)随培养时间t的变化。数据以mean±SD表示，n=3

　　最后，在整个培养过程中，我们观察到细胞积累虾青素的能力在较低的初始生物量浓度(=0.52 kg m?3)下表现出更强的能力。具体来说，在这种条件下虾青素含量增加了约90%，而当初始生物量浓度较高(=2.21 kg m?3)时，虾青素含量仅增加了70%。由于所有氮饥饿培养均暴露于相同的PFD(250μmolhν?2 s?1)，因此PBR内光衰减和细胞辐射特性(取决于色素含量)的差异可能是导致不同批次虾青素代谢变化的因素。

　　这些结果表明，较低的初始生物量浓度会导致PBR内的光衰减减少。因此，这种情况确保细胞获得足够的光子吸收，从而激活类胡萝卜素的生物合成途径，最终增强虾青素的积累。值得注意的是，这些结果与之前关于初始生物量浓度(Wang et al. 2013a, b)和入射光强度(Li et al. 2010;Zhang et al. 2018)，均研究了雨芽虾细胞在氮饥饿条件下虾青素的积累。这些共同的发现表明，虾青素积累的改善可能与培养基中更好的光照条件有关，这是影响光能转移的主要因素。

　　质量吸收截面

　　图4显示了在初始生物量浓度为0.52 kg m?3的间歇培养条件下，雨水蛭在400 ~ 700 nm光谱区域的光谱质量吸收截面随时间的变化。

　　图4

　　

　　在初始生物量浓度为0.52 kg m?3的PFD为250μmolhν m?2 s?1的条件下，批培养突然缺氮时雨水蛭的光谱质量吸收截面随波长λ的变化。数据以mean±SD表示，n=3

　　总的来说，在PAR区域内的所有波长上，随着时间的推移呈现出一致的下降。即使考虑到不同的初始生物量浓度(数据未显示)，这一趋势也是一致的。随着时间的推移，总体下降趋势与叶绿素含量Wchl的持续下降趋势基本一致，如图1a所示。

　　在氮饥饿培养中，雨淋菌培养物的大小和形状略有变化。例如，叶绿素a吸收峰对应的435 nm和676 nm处的质量吸收截面，在初始生物量浓度为0.52 kg m?3的培养10天后，分别从初始值115和102 m2 kg?1下降到仅37和13 m2 kg?1。在同一时间段内，chl-a含量Wchl-a从0.8 DW下降到0.06% DW，这在随后对PBR内par平均通量的分析中可以看到(图5)。

　　值得注意的是，随时间的变化也可能受到细胞大小或细胞生化成分(如色素)变化的影响(Jonasz和Fournier 2007)。将这些观察到的变化归因于任何特定参数都是具有挑战性的，因为雨水蛭对氮饥饿的复杂生物反应涉及形态特征、色素谱和含量的重大转变，正如先前的研究所记录的那样(Flynn et al. 1993;Fan et al. 1998)。

　　局部影响率

　　图5显示了par平均通量随PBR深度z的变化。这种变化是基于在突然饥饿实验中观察到的辐射特征，特别是在两个时间点:立即(第0天)和10天后。这些实验在初始生物量浓度为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m - 3的情况下进行。

　　图5

　　

　　当初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m - 3时，暴露于250μmolhν m - 2 s - 1的PFD的间歇培养突然氮饥饿开始(t=0)和结束(t=10)时，雨芽草的par平均通量率与PBR深度z的函数关系。数据以mean±SD表示，n=3

　　正如预期的那样，由于较低的光衰减，在任何给定时间，生物量浓度较小的培养物的通量率都较大。有趣的是，尽管生物量浓度显著增加，但对于所有四个批次，培养10天后的通量率都大于初始通量率(见图1b)。这种现象可归因于质量吸收截面的减小(如图4所示)，这比生物量浓度的增加对光传递的影响更大。Pruvost等人(2009)和Kandilian等人(2014)分别报道，在平板PBR中对Neochloris oleo富足和Nannochloropsis oculata进行氮饥饿实验时观察到类似的结果。

　　然而，重要的是要注意，通量本身并不能表明细胞吸收的光量(Pruvost and Cornet 2012)。吸收截面也必须考虑在内，因为它代表光子吸收能力，受细胞色素沉着的影响。在氮饥饿的情况下，考虑到吸收截面的急剧下降与可用光的增加同时发生，如通量所示，这一考虑变得至关重要。这些值随时间的动态变化使对MRPA值的总体影响的预测复杂化，MRPA值结合了这两个量，有助于培养体积内细胞的有效光吸收。

　　平均光子吸收率

　　图6显示了每次突然氮饥饿培养的平均光子吸收MRPA速率与时间的关系。它是用相应的实验测量的日平均质量吸收截面来计算的。同样，对于初始生物量浓度较小的批次，MRPA在任何时候都较大。考虑到接种时的色素含量相似，这可能归因于PBR中相应的较大的通量(图5)。此外，所有批次的MRPA都随着时间的推移而降低。例如，在0.52 kg m?3的突然氮饥饿实验中，最初的MRPA为10000μmolhν kgx?1 s?1，但在10天后下降到3300μmolhν kgx?1 s?1。这似乎有悖直觉，因为在氮饥饿期间，通量率增加了(图5)。然而，质量吸收截面的减少占主导地位，而不是通量率的增加。如前所述，MRPA表示微藻吸收的光子量，而通量率仅表示PBR中给定位置的可用光。MRPA的下降表明，平均而言，氮饥饿期间每个细胞吸收的能量减少。这可能会对细胞分裂和虾青素合成产生负面影响。事实上，微藻依靠吸收入射光子来进行生化反应。它们不能吸收光，这可能会降低它们进行光合作用和固定无机碳的效率(Williams and Laurens 2010)。

　　图6

　　

　　当初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m - 3时，在PFD为250μmolhν m?2 s?1的条件下，突然氮饥饿间歇培养的雨芽草光子吸收MRPA的平均速率随培养时间t的变化而变化。数据以mean±SD表示，n=3

　　我们之前对MRPA值的研究已经扩展到评估在四种不同初始生物量浓度引起的不同光衰减条件下，MRPA值对缺氮细胞虾青素代谢的影响。这一趋势类似于Kandilian等人(2014,2019)对tag -脂质合成的观察结果，表明如果虾青素的产生受到光吸收速率(称为“光胁迫”)的影响，那么虾青素的产生速率应该与MRPA相关。根据Eq. 8和Eq. 9，利用实验数据在离散时间点计算日平均面积虾青素产量和日平均MRPA < >。

　　在图7中，我们给出了四种不同初始生物量浓度的突然饥饿实验的日平均面积虾青素产量与日平均MRPA之间的关系图。一个显著的抛物线关系出现了，当< >达到7000±100μmolhν kgx?1 s?1时，在0.29±0.05 g m?2 d?1处达到峰值(所有数据见附加文件1)。这一关系强调了单靠氮饥饿并不能保证高虾青素产量。这表明虾青素的生物合成动力学还受到光子吸收率的限制，以日平均MRPA < >为代表。这反映了在最佳条件下生长的微藻的情况，其中生物量生产力主要受光供应的限制。

　　图7

　　

　　在初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m - 3的PFD为250μmolhν m?2 s?1条件下，突然氮饥饿时雨芽虾青素日平均面积产量随日平均光子吸收速率的变化变化规律< >。数据以mean±SD表示，n=3

　　提高微藻单位质量MRPA可以通过降低生物量浓度来实现。然而，正如之前的研究所指出的，低于最佳MRPA值会导致PBR生物量生产力下降和光吸收不完全(Pruvost and Cornet 2012;Takache et al. 2012)。在这种情况下(称为动力学状态)，生物量生产力受到微藻生物合成速率的限制。

　　日平均MRPA < >超过其最优值会导致日平均虾青素产量下降。然而，由于叶绿素含量和质量吸收截面的减少，氮饥饿期间PBR无法完全吸收光。这种情况表明虾青素在细胞内积累的生物学极限已经达到。例如，通过将初始生物量浓度从2.21降低到0.21 kg m?3，可以在培养第一天将< >从3800增加到12000μmolhν kgx?1 s?1。在培养的第2天和第3天，细胞DW分别为0.81%和1.17%。然而，两批PBR中相应的虾青素浓度差异显著(第2天分别为22.72和2.59 g m?3，第3天分别为31.39和3.79 g m?3)。因此，增加MRPA不影响单细胞虾青素浓度，但由于生物量浓度降低，导致日平均虾青素产量降低。

　　此外，在整个批次培养期间，初始生物量浓度为2.21 ~ 1.39 kg m?3的试验之间的生物量浓度的时间演化存在差异。然而，两种实验在培养4天后虾青素浓度相似(Casta=32.51 g m?3)。有趣的是，初始生物量浓度为1.39 kg m?3的PBR在培养前4天的日平均虾青素产量超过了初始生物量浓度为2.21 kg m?3的PBR，这是因为其初始虾青素浓度较低(Casta=5.08 g m?3)。然而，在第3天和第4天之间，两个实验显示出相似的虾青素浓度(见图3a)，因此相似的日平均虾青素产量(=0.041±0.006 g m?2 d?1)。值得注意的是，他们都保持了相当的日平均MRPA值< >。这在图7中很明显，两个实验的数据聚集在一起的日平均MRPA值< >范围从3000到5000μmolhν kgx?1 s?1。这突出了我们将MRPA与虾青素产量相关联的方法在量化和优化“光胁迫”方面的实用性。尽管生物量和叶绿素浓度存在差异，但具有相似MRPA值的培养物表现出相似的虾青素产量。

　　综上所述，在实践中，可以根据入射PFD和PBR厚度，通过改变初始生物量浓度来调整初始MRPA值(MRPA0)，从而优化虾青素产量。

　　经过10 d的突然氮饥饿试验，4种不同虾青素含量的培养物在初始生物量浓度分别为0.21、0.52、1.39和2.21 kg m?3时的DW分别为2.49%、3.21%、1.69%和1.18%。这些发现如图8所示，说明了虾青素细胞含量与初始MRPA0之间的关系。该图突出了临界初始MRPA值()的存在，在该值之上细胞积累了大量虾青素。

　　图8

　　

　　突然氮饥饿10 d后细胞虾青素浓度与初始平均光子吸收速率MRPA0的函数关系。数据以mean±SD表示，n=3

　　重要的是，估计的临界初始值约为7000±500μmolhν kgx?1 s?1。值得注意的是，在突然饥饿栽培的最初几天，超过这个临界值会带来重大挑战。如图6所示，这一挑战源于在最初培养期间观察到的MRPA显著下降。这种下降是叶绿素含量迅速减少(如图1a所示)和生物量浓度增加(如图1b所示)的结果。因此，为了在批量培养的细胞中获得大量虾青素含量，需要精确调整批量培养中的初始生物量浓度，以使MRPA0值超过7000±500μmolhν kgx?1 s?1的临界值。

　　在氮饥饿条件下，这个临界值对应于细胞合成虾青素的速度超过碳水化合物、蛋白质和其他细胞成分的合成速度。众所周知，氮饥饿是微藻的一个强有力的胁迫条件，影响叶绿素和蛋白质的生物合成。微藻暴露于缺氮条件下往往会改变其代谢过程，导致脂质和类胡萝卜素的积累，如先前研究所报道的那样(Berges等人，1996;Cakmak et al. 2012;Schmollinger et al. 2014)。以雨水蛭为例，氮饥饿和高光照水平的结合引发淀粉降解，碳水化合物和脂肪酸的积累，以及三羧酸循环活性的增加(Boussiba和Vonshak 1991;Recht et al. 2014)。在氮饥饿条件下，虾青素的合成被激活，作为电子汇，防止光合作用电子传递链中过量自由基的形成(Hu et al. 2008)。此外，有研究表明，H. pluvialis增强循环电子传递，以保护氮饥饿条件下的光合机构(Scibilia et al. 2015)。

　　需要强调的是，长时间暴露在强光条件下会破坏光合机构，导致非光化学猝灭(NPQ)等光保护机制的激活(Scibilia et al. 2015;Chekanov et al. 2019)。当光合作用中光能的吸收超过其利用能力时，NPQ起着调节和保护光合机构的作用。在这种情况下，一些被吸收的光作为热量消散，而不是用于虾青素的合成，这可能会降低虾青素的产量。这种情况与初始生物量浓度为0.21 kg m?3的培养相似，其MRPA0最高(12000μmolhν kgx?1 s?1)，而虾青素浓度最低(Casta=8.4 g m?3)。如前所述，该培养具有最低的生物量浓度和生产力(Cx=0.34 kg m?3,Sx=0.43 g m?2 d?1)，叶绿素含量急剧降低(Wchl=0.05±0.001% DW)。这种减少导致细胞白化率和死亡率高，如图2所示。这一现象在图5和图6中更加明显，图5和图6显示了在10天的批量培养中，不同培养深度下的高通量和高平均光子吸收MRPA率。这些观察结果证实，每次入射光都没有被细胞充分利用来合成虾青素;相反，它会以热量的形式消散，最终减少虾青素的积累。这些发现与Wang等人(2013a, b)在极低初始生物量浓度(=0.1 kg m?3)的氮饥饿条件下培养雨芽草(H. pluvialis)的结果一致。

　　相比之下，在初始生物量浓度为0.52 kg m?3,MRPA0值约为9900μmolhν kgx?1 s?1的培养中，日平均MRPA < >(如图7所示)在确保虾青素高产率方面发挥了关键作用。这一有利条件导致细胞中虾青素的干重(DW%)高达3.21%。在这种情况下，特别有趣的是初始临界MRPA值与日平均MRPA < >之间的紧密匹配，这对应于日平均面积虾青素产量的峰值。这种一致性可以归因于一个重要的观察结果:细胞内虾青素浓度的显著增加和每日产量的峰值发生在氮饥饿的最初4天。在这个关键时间段内，日平均MRPA < >与初始MRPA0密切相关，这解释了两个参数的最优值的相似性。

　　此外，值得一提的是，当将结果外推到不同的文化系统时，对实际生产力的计算具有有价值的见解。在初始生物量浓度为0.52 kg m?3的具体实验中，获得的批量面积生物量产量最高可达3.27 g m?2 d?1，虾青素产量最高可达0.29 g m?2 d?1。值得注意的是，我们的观察强调了通过优化PBR中的MRPA来提高生产力的巨大潜力。这一观察结果与Pruvost和Cornet(2012)以及Kandilian等人(2014、2019)之前的研究结果一致，在这些研究中，MRPA被有效地用于优化pbr中微藻的生物量和脂质生产率。这强调了MRPA作为优化各种PBR尺度虾青素产量的有价值工具的多功能性。然而，必须强调的是，这种优化方法的有效性取决于严格进行辐射传输分析，以准确估计MRPA。

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